مقاله بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسن

مقاله بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسن در 40 صفحه ورد قابل ویرایش

دسته بندی	کشاورزی و زراعت
فرمت فایل	doc
حجم فایل	53 کیلو بایت
تعداد صفحات فایل	40

دریافت فایل

فروشنده فایل

کد کاربری 6017

تمام فایل ها

مقاله بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسن در 40 صفحه ورد قابل ویرایش

مقدمه

آفلاتوکسین‌ها گروهی از مایکوتوکسین‌ها با قدرت سرطان‌زایی، جهش‌زایی و کاهش کارآیی سیستم ایمنی، می‌باشند (Eatan &Gallagher , 1294; IARC , 1993) آنها از متابولیت‌های ثانویه سنتز شده توسط سویه های سم‌زای ASpergillus flavus , Aspergillus parasiticvs و Aspergillus nomius می‌باشند. آفلاتوکسین B1 با توجه به پتانسیل بالاتری که دارد، بیشتر مورد توجه قرار دارد. رشد قارچهای مولد سم وآلوده شدن به آفلاتوکسین در بسیاری از محصولات غذایی دیده می‌شود (Wood , 1989). در صورت مصرف غذاهای آلوده به سموم آفلاتوکسین B1­ و B2، این سموم به‌آفلاتوکسین‌های M1 و M2 متابولیزه می‌شوند و به درون بافت‌هاومایعات بیولوژیکی و شیر حیوانات شیرده ترشح می‌شوند (Zarba etal , 1992).

سویه‌های گونه‌های Bifidiobacterium , Lactobacillus , Lactococcus در تولید محصولات شیری تخمیری به عنوان استارتر کالچر و تولید کننده طعم و بو، به کار می‌روند نقش اصلی این کشت‌ها تولید اسیدهای آلی مثل اسیدلاکتیک در طی مراحل تخمیر است که سبب افزایش عمر قفسه‌ای محصولات می‌شود و هم محتویات حساس آنها را تغییر می‌دهد.

اگر شیر به آفلاتوکسین‌ آلوده باشد، احتمال تخریب مرحله تخمیر و تولید ترکیباتی با بوی تغییر یافته و ناخواسته را در محصول ایجاد می‌کند (Sutic & Banina , 1990).

اخیراً EL – Nezami و همکارانش (1996 , 1998) گزارشاتی ارائه داده‌اند مبنی بر وجود سویه‌های خاص لاکتوباسیل‌ که توانسته‌اند آفلاتوکسین‌ها را از محلول آبی جداکنند. به علاوه سویه‌های خاصی از باکتری‌های اسید لاکتیک، توانسته‌اند آفلاتوکسین M1 را از شیر آلوده هم جداکنند (Pierides etal . ;2000). جداسازی آفلاتوکسین در نتیجه اتصال فیزیکی سم به دیواره سلولی یا ترکیبات دیواره سلولی است (Haskard et al. 2000 ; EL- Nezami et al. 1998 b).

همچنین جداسازی بعضی متابولیت‌های ضدقارچی مثل دی‌پپتیهدهای حلقوی و فنیل‌لاکتیک اسید و اسیدهای چرب هیدورکسیله شده از باکتری‌های اسیدلاکتیک، توانایی این گونه‌ها در بازدارندگی رشد قارچ‌های فاسد کننده مواد غذایی و مواد سم‌آفلاتوکسین را نشان می‌دهد.
آفلاتوکسین در ذرت

متابولیتهای سمی تولید شده توسط قارچها، که به عنوان مایکوتوکسین شناخته می‌شوند، در طی چند سال اخیر بسیار مورد توجه واقع شده‌اند. مایکوتوکسین‌ها امروزه به عنوان تهدید کننده‌های سلامتی در حیوانات شناخته شده‌اند که بیماری‌هایی مثل equine leukoencephalo malaci در اسب‌ها و Porcine edema را در خوک‌ها ایجاد می‌کنند. کاهش وزن، کاهش باروری و کاهش مقاومت در برابر بیماریها و حتی مرگ را به مایکوتوکسین نسبت داده‌اند. هیچ حیوانی نسبت به آنها مقاوم نیست ولی به طور کلی حیوانات پیرتر مقاوم‌تر از حیوانات جوان هستند. بعضی مایکوتوکسین‌ها، مثل آفلاتوکسین در سلامتی‌اشان هم مخاطراتی را ایجاد می‌کنند. این مایکوتوکسین به عنوان یک موتاژن شناخته شده است. شناسایی آفلاتوکسین در ذرت می‌تواند باعث کاهش قیمت آن جهت بذر و یا حتی معدوم ساختن آن شود. آلودگی با مایکوتوکسین ها ارتباط مستقیم با تاثیرات جوی دارد.

قارچ Aspergillus Flavus تولید کننده آفلاتوکسین در محصولاتی مثل ذرت، پنبه‌دانه و بادام زمینی است. قارچ به طور معمول در طبیعت وجود دارد، اما مقدار آن در هوای گرم و خشک افزایش می‌یابد. آلودگی آفلاتوکسین در ذرت‌هایی بیشتر است که تحت شرایط استرس تولید شده‌اند. بنابراین، خشکی، گرما، حشرات، کرم‌ها و استرس‌ ناشی از بارورکنندگی همگی منجر به ایجاد مقادیر بالای آفلاتوکسین در گیاه می‌شوند. تلاش برای ایجاد هیبریدهای ذرتی که به آلودگی قارچی مقاوم باشند و سم را در خود انباشته نکنند، وجود دارد، با وجود این هیبریدها بسیار مقاوم هستند ولی از تجمع سم به طور کلی نمی توان جلوگیری کرد. با کاهش استرس و مراقبت از حمله حشرات می‌توان در مقدار آفلاتوکسین کاهش ایجاد کرد (CAST , 1999) .

دمای Fْ100-80 و رطوبت نسبی %85 (% 20-18 رطوبت در دانه‌ها وجود دارد) شرایطی بهینه برای تولید سم و رشد قارچ است.

از طرف دیگر مصرف‌ این محصولات به عنوان خوراک دام می‌تواند سبب ایجاد انواع دیگری از آفلاتوکسین‌ها (M1 , M­2) در شیر حیوانات شود. آلودگی ذرت به عنوان غذای دام و طیور و نیز ماده اولیه جهت فراهم کردن انواع گسترده‌ای از مواد غذایی و تنقلات، دارای اهمیت ویژه‌ای است و کاهش آفلاتوکسین به روشهای مختلف ضروری می‌باشد.

محصولات کشاورزی مثل ذرت، علوفه، بنشن، گندم و یونجه را می‌توان با سیلوکردن نگاهداری کرد. در بسیاری از کشورها محصولات سیلویی دارای ارزش غذایی بالاتری به خصوص برای دام‌ها می‌باشند. در کشورهای اروپایی مثل هلند، آلمان و دانمارک بیش از %90 محصولات تولیدی در سیلوها نگاهداری می‌شوند. حتی در کشورهایی با شرایط عمومی آب وهوایی مناسب جهت خشک کردن مثل فرانسه و ایتالیا، حدود %50 از محصولات خود را در سیلوها نگاهداری می کنند. (wilkson et al.1996) . جهت تولید سیلویی با کیفیت بالا نیاز به مراحل تخمیر میکروبی مناسب وجود دارد. میکروارگانیسم‌های دخیل در مراحل تخمیر سیلوها، علاوه بر افزایش کیفیت غذایی محصول، قادر خواهند بود تا از رشد میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا و همچنین قارچ‌های مولد توکسین، جلوگیری کنند.

از آنجاییکه سیلوکردن محصولات بر پایه تخمیرهای متنوع اسید لاکتیکی تحت شرایط بی‌هوازی است، به کار بردن سویه‌های باکتریایی تولیدکننده اسیدلاکتیک که در سم‌زدایی و کاهش تولید آفلاتوکسین مؤثر هستند، منطقی‌تر به نظر می‌رسد. باکتری‌های اسیدلاکتیک محیطی و ساپروفیت موجود در محصولات، کربوهیدارتهای محلول در آب (WSC) موجود در محصولات را به اسیدلاکتیک و نیز مقدار کمی اسیداستیک تخمیر می‌کنند. بر اثر تولید این اسیدها، PH مواد سیلو شده پایین آمده و رشد میکروارگانیسم‌های فاسدکننده، باز داشته می‌شود. باکتری‌های اسیدلاکتیکی که عمدتاً در سیلوها یافت می‌شوند. اعضای جنسی‌های لاکتوبا سیلوس، پدیوکوکوس، لوکونوستوک، انتروکوکوس، لاکتوکوکوس و استرپتوکوکوس می‌باشند. اکثر باکتری‌های اسیدلاکتیک موجود در سیلوها، مزوفیل‌اند، یعنی در دمای بین Cْ50-5 رشد می‌کنند که دمای بهینه رشد آنها بین Cْ40-25 می‌باشد. آنها PH سیلو را تا 5-4 پایین می‌آورند که این به گونه و شرایط محصول بستگی دارد.

همه باکتری‌های اسیدلاکتیکی هوازی های اختیاری‌ اند اما بعضی شرایط بی‌هوازی را ترجیح می‌دهند (Holzapfel and schillinger , 1992; Teuber et al. 1992) . جمعیت LAB در فاصله بین دروکردن و سیلو کردن محصول افزایش می‌یابد، که این بر اثر احیاء حالت‌های تاخیری است و نه اضافه کردن مصنوعی و تلقیح میکروارگانیسم. محتوای قندی و ترکیبات قندی موجود در محصول و مقدار ماده خشک و شرایط اسیدی و اسمزی موجود در سیلو، بر رشد و رقابت باکتری‌های اسید لاکتیک در تخمیر سیلویی تأثیر می‌گذارند. فاز تخمیری سیلوها در زمانیکه شرایط سیلو بی‌هوازی شود، آغاز می شود که این عمل معمولاً بعد از چند ساعت از سیلوکردن که اکسیژن اتمسفری موجود در اعضای گیاه و فواصل محصول خارج شد، آغاز می‌شود و بسته به نوع محصول سیلو شده و شرایط سیلو، برای چند روز تا چند هفته ادامه پیدا می‌کند. در این فاز، لاکتو باسیل‌ها میکروارگانیسم‌های غالب سیلو هستند و PH سیلو را با توجه به عمل تخمیر خود بین 5-8/3 پایین می‌آورند.

در فاز سوم که فاز ثابت می‌باشد که در صورت عدم دخول هوا به داخل سیلو، در بعضی مواقع به وجود می‌آید. در این حالت اکثر میکروارگانیسم‌های فاز تخمیری کاهش پیدا می‌کنند و تنها بعضی باکتری‌های مقاوم به اسید که قادر به تولید پروتئازها و کربوهیدراتازهای مقاوم به اسید هستند، مثل lactobacillus buchneri در مقادیر کم قادر به رشد خواهند بود.

در فاز چهارم که به محض قرار گرفتن سیلو در برابر هوا آغاز می‌شود، اسید آلی نگاهدارنده تولید شده توسط مخمرها و گاهی نیز باکتری‌های اسید استیک تخریب می‌شوند و درنتیجه PH بالا می‌رود و در مرحله بعد میکروارگانیسم‌های فاسد کننده شروع به فعالیت می‌کنند و قارچ‌های تولیدکننده توکسین‌ مثل آسپرژیلوس فلاووس در این مرحله شروع به رشد و تولید سم می‌کنند (Nout et al, 1993) .

به نظر می‌رسد که نگاهداری سیلو در فازهای 2 و 3 با استفاده از افزودنیها و کاهش اکسیژن در هنگام سیلوکردن محصول، باعث جلوگیری از فساد قارچی و تولید سم خواهد شد.(Ste Fanie J. W. H. Oude Elferin Ketae. 2000) .

خصوصیات بیولوژیکی و مورفولوژیکی Aspergillus Flavus

آسپرژیلوس فلاووس متعلق به جنس آسپرژیلوس است که دومین گونه متداول بعد از آسپرژیلوس فومیگاتوس می‌باشد. کلنی‌های A. flavus سریع رشد می‌کنند و قطر کلنی آنها به cm 7-6 در 14-10 روز می‌رسد. رنگ کلنی در ابتدا زرد است و سپس به زرد متمایل به سبز یا سبز زیتونی تبدیل می‌شود. کلنی‌های قدیمی سبز تیره می‌شوند. شکل کلنی‌ها صاف است و بعضی دارای چروک‌های شعاعی‌اند. پشت کلنی بدون رنگ و یا به رنگ کرم است. محیط افتراقی، A. flavus , parasiticus آگار (AFPB) است که برای غربالگری و شناسایی گونه‌های A. flavus طراحی شده است. I- Pitt , A.D.Hocking , 1985; H.Govrama , L.B.Bullerman ,1995 A.parasiticus , A. Flavas در این محیط با تولید اسپورهای تیپیک زرد تا سبز زیتونی و پشت کلنی نارنجی روشن، متمایز می‌شوند. (K. B. Raper, (D.I.Fennell,1965) . جزئیات بیشتر را می توان زیر میکروسکوپ الکترونی اسکنینک (SEM) دید: کنیدیوسپورها بلند هستند ( 800 -400) و اغلب ظاهری سخت درست در کنار وزیکول‌های کروی دارد (253-24). فیلایدها به شکل پیرامونی بلند شده‌اند و در دو ردیف قرار دارند و بعضی اوقات تک ردیفی هستند؛ شکل سرهای کنیدیال از ستونی تا شعاعی و کروی متغیر است؛ طرز قرارگیری فیلایدها بر روی وزیکول شکل سرکنیدیال را تعیین می‌کند. قطر آنها بین 65 -10 متغیر است (J.I.PiH & A.D.Hocking 1985) کنیدی‌ها از جدایی‌های A. flavus صاف تا کمی خشن هستند، در حالیکه کنیدی‌ها از A. Parasiticus خشن هستند. گونه‌های خاصی تولید اسکلروتیای قهوه‌ای می‌کنند.

گونه‌های آسپرژیلوس فلاووس در خاک وجود دارند و طیف وسیعی از محصولات کشاورزی را در مزرعه‌ محل‌های نگهداری و نیز در طی فرآوری‌ و توزیع آلوده می‌کنند. Aspergillus Flavus زیرگونه A. bombycis , A.tamarii, A. nomius, Parasiticus تنها قارچهایی هستند که تولید آفلاتوکسین در آنها نشان داده شده است (C. P.Kurtmon, 1987 S. W. peterson, Y.Ito, B.W.Horn, T.Go to 2001; C.W.Hesseltin, B.W.Horn ).

سویه های آسپرژیلوس فلاووس دارای انواع غیرسم‌زا و تولید کننده‌های آفلاتوکسین (B1 , B2, ) می‌باشد که در این بین A. Flavus زیرگونه پارازیتیکوس، آفلاتوکسین‌های B1, B2, G1, G­2. (AFG2, AFG1,AFB1, AFB2 ) را تولید می‌کند و جدایی‌های غیرسم‌زایی که آفلاتوکسین تولید نمی‌کنند در طبیعت نادر است (Du sanee Thanaboripat, Yang Qian, Lliu Ruigian, 2001)
تولید آفلاتوکسین

تخمین غلظت باکتریایی.

جهت تعیین مقدار مشخصی از باکتری مورد نظر، ازمقایسه نمونه ها با شاهد مک فارلند استفاده کردیم. برای به دست آوردن تعداد تقریبی 109*9 باکتری درهر میلی لیتر، درهرلوله 3ml ازمحیط کشت مایع MRS را ریختیم تا کدورتی مشابه کدورت مک فارلند 10 پیدا کند(جذب نمونه ها در 600nm خوانده شده) بعد از تطبیق OD نمونه ها با شاهد مک فارلند، نمونه ها سانتریفوژ شده ، محیط کشت MRS دورریخته شد و حدود 3ml محلول فسفات با فرسالین (PBS) با PH 7/23 ریخته شد و بعد از یکنواخت کردن سوسپانسیون باکتری در PBS مجدداً عمل سانتریفوژ (به مدت 12min بادور 2500-3000 rpm) صورت گرفت و مایع رویی دورریخته شد. این مرحله رادوبار تکرار کردیم و بدین ترتیب هیچ محیط کشتی درسوسپانسیون باکتریایی باقی نماند و رسوب باکتریایی که درانتها به دست آمد را برای اضافه کردن محلول آفلاتوکسین کنار میگذاریم (k.peltonen,w.El.nezami,2001).
تعیین منحنی رشد باکتری

دراین مرحله به دلیل مقایسه جذب آفلاتوکسین توسط لاکتوباسیلوس درفازهای رشد و سکون و مرگ، منحنی رشد باکتری را تعیین کردیم. بدین منظور، ازسوسپانسیون باکتریایی را به محیط کشت MRS مایع تلقیح کردیم و درفواصل زمانی 2h مقدارOO را درطول موج 600 nm خواندیم . درنهایت منحنی رشد باکتری را براساس مقدار جذب به زمان رسم کردیم و مراحل فاز رشد و سکون تعیین شد.

برای بررسی مقدار کاهش آفلاتوکسین درحالت مرگ باکتری، سوسپانسیون باکتری مقایسه شده با 10 مک فارلند را اتوکلاو کردیم، تا باکتری ها کاملاً ازبین بروند، سپس سانتریوفوژ کرده و به رسوب باکتریایی محلول آفلاتوکسین اضافه کردیم.

همچنین جهت بررسی میزان رشد یا عدم رشد سویه باکتری بهینه درمحلول آفلاتوکسین مورد آزمایش و نیز PBS به تنهایی، درطول مدت 120h مقدار جذب محلول رادرطول موج 600 nm خواندیم و روند رشد باکتری رادراین محلول ها بررسی کردیم.
تعیین میزان کاهش آفلاتوکسین

(Sigma,st.louis,Mo.)AFB1 درمتانول حل شد و غلظت آن را با خواندن جذب آن به وسیله اسپکتروفوتومتری (unicam 5625 uv/vis) درطول موج 365 nm (4 = 21500 M-1cm-1) و نیز معادله lamber-beer به دست آوردیم وبرای تهیه 25ml محلول آفلاتوکسین 5ppm، 11/3 ml ازمحلول را در evaporator گذاشتیم و متانول آن را تبخیر کردیم و سپس به وسیله PBS به حجم رساندیم و بدین ترتیب، محلول آفلاتوکسین باغلظت (gr/ml) 5ppmبه دست آوردیم. از این محلول 5ppm ، محلولهای دیگری با غلظت های 1000ppb (ngr/ml)و500و400و200و100و50 جهت مقایسه اثر کاهش درغلظتهای مختلف ونیز کالبراسیون دستگاه HPLC تهیه کردیم.

؟

به رسوبات باکتری تهیه شده درمرحله قبل، 1/5 ml ازمحلول آفلاتوکسppm)B1 5/0)اضافه کردیم و درمدت زمانهای مختلف دردمای Cْ37 گرماگذاری کردیم. برای هر سویه باکتریایی، یک شاهد باکتریایی (باکتری تلقیح شده در PBS) و یک شاهد AFB1 (5/0 آفلاتوکسین B1 در PBS) گذاشتیم (k.peltanen,H.EL.Nezamie,2001)

درهر مرحله زمانی، جهت بررسی مقدار AFB1 کاهش نیافته، بعد از سانتریوفوژ کردن محلول ها و رسوب دادن باکتریها 100 ,(2500-3000 rpm,12min) از فاز مایع راجهت بررسی برمی داریم. زمان گرماگذاری تا 90 h ادامه یافت و درمقاطع زمانی 1,24,48,90 h ازمایع رویی محلول باکتری و AFB1 برداشت شد. کلیه بررسی‌ها سه تکرار داشتند.
اثر شستشو بربازگشت آفلاتوکسین کاهش یافته

بعد از اتمام دوره گرماگذاری و برداشتن 100 مایع رویی محلول درمقاطع زمانی مختلف، درانتهای 90h، مایع رویی دور ریخته شده و رسوب باکتریایی به وسیله 2ml محلول PBS شسته می شود. بدین صورت که بعد از اضافه کردن PBS و یکنواخت کردن سوسپانسیون، آن را به مدت 10min دردمای Cْ37 گرماگذاری کردیم و سپس مجدداً سوسپانسیون را سانتریوفوژ کردیم و 100 ازمایع رویی را برای سنجش میزان آفلاتوکسین آزاد شده بررسی کردیم. این عمل را سه بار تکرار کردیم و بعد از هر بار شستشو مقدار آفلاتوکسین آزاد شده را بررسی کردیم.

(Carolyn A.Haskard et al,2001;K.Peltonen,W.EI.Nezami,2001)

تعیین مقدار AEB1 باقی مانده درمایع رویی نمونه ها

مایع رویی نمونه ها به وسیله دستگاه HPLC برای تعیین میزان AFB1 کاهش یافته توسط باکتری مورد نظر با استفاده از این فرمول محاسبه شد(K.Peltonen et al,2001)

؟

ازاین شاهد AFB1 برای تعیین میزان AFB1 آزاد شده پس از شستشو هم استفاده شد.
HPLC

جهت تعیین میزان آفلاتوکسین از روش HPLC فاز معکوس بدون روش استخراج، استفاده شد (EL-Nezami et al,1998a). سیستم HPL3 (Cat No.CTS-03525) (Serial.No.880-06, Lot.No.26/275 شامل یک سیستم انتقال دهنده فاز سیال دو پمپی ، دتکتور UV و یک ستون ODS spheri-5 C18 با ابعاد 2504/6mm بود. حجم نمونه تزریقی معادل 70 بودوفاز سیال عبارت بود از :آب مقطر/متانول/استونیتریل ;vol/vol/vol) 58/21/21)که دارای Flow rate یاسرعت جریان 1/25ml/min بود. طول موج دتکتور UV برروی 365nm تنظیم شده بود.

ابتدا به وسیله هفت محلول استاندارد آفلاتوکسین B1 تهیه شده درمراحل قبل ، منحنی کالیبراسیون دستگاه تهیه شد .

(Kalantri, H, zandamoghadam A,Ahvaz-Iran;A.manda,B.P.Naidu,Nageswara Rao C.2004)
سویه های قارچی و شرایط کشت

جدایی آسپرژیلوس فلاووس توکسین‌زا (MAS 915 ;473.5 ppb) ازموسسه دفع آفات و بیماریهای گیاهی، بخش مایکوتوکسین، تهیه شد. یک کشت Slant ازآن تهیه شد(برروی Potato Dextrose Agav,PDA) به مدت یک هفته دردمای Cْ30 نگهداری شد. برای شمارش تعداد اسپورها، PBS 5ml به درون لوله ریخته شد و بعد ازشستشوی کامل، سوسپانسیون حاوی اسپورهای قارچی به لوله استریلی که حاوی 50 توئین 80 استریل شده بود، انتقال داده شد. سپس 50 از سوسپانسیون حاصل را برروی لام نئو بارگذاشتیم و تعداد اسپورها راشمارش کردیم. کل تعداد اسپورها را به 400تقسیم کردیم تا دراین صورت مقدار اسپور موجود درهر مربع کوچک را بیابیم، سپس از آنجاییکه این تعداد درحجم 1/4000,000ml هر مربع می باشد باید رقم حاصل رادر 4000,000 ضرب بکنیم و بدین گونه، تعداد اسپورها را هرمیلی لیتر محاسبه کردیم. جهت تهیه 103 و 106اسپور، رقتهای متوالی تهیه کردیم، تا به تعداد مورد نظر برسیم.

(jesper magnusson, Johan schnurer, 2000, katrin strom, Jorgen sjogren, 2002)

تحقیق بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسنفایل بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسنمقاله بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسندانلود تحقیق بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسنبررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاترکیسننحوه تولیدسم‌زداییآفلاترکیسن